轉(zhuǎn)染試劑是一種試劑 轉(zhuǎn)染試劑是一種適合于把質(zhì)粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。
轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)點(diǎn)
1、轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，操作簡單。
2、無明顯細(xì)胞毒性，用 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，大多數(shù)細(xì)胞72小時(shí)內(nèi)不更換培養(yǎng)液無明顯細(xì)胞毒性。
3、 轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞都適用，并且可以用于穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。
使用說明
1. 細(xì)胞培養(yǎng)：以293T細(xì)胞為例，轉(zhuǎn)染前一天(20-24小時(shí)) ~0.4×106 細(xì)胞(具體的細(xì)胞數(shù)量據(jù)細(xì)胞大小和細(xì)胞生長速度而定)鋪到六孔板內(nèi)，使第二天細(xì)胞匯合度（confluent）能達(dá)到約50%~70%。
2. 在進(jìn)行下述轉(zhuǎn)染步驟前，把六孔板每孔內(nèi)換成新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的體積約為2 ml。
注：其他培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)液體積參見《各種培養(yǎng)介質(zhì)下 轉(zhuǎn)染DNA詳表》，抗生素、Glutamine等對(duì) 轉(zhuǎn)染并無影響。如果LipoFiter對(duì)目的細(xì)胞毒性較大，轉(zhuǎn)染試劑建議去除轉(zhuǎn)染體系內(nèi)的抗生素。
3. 把 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻。
4.對(duì)于待轉(zhuǎn)染的六孔板中一個(gè)孔的細(xì)胞，取一只潔凈無菌離心管，加入4 mg質(zhì)粒DNA（其他培養(yǎng)介質(zhì)DNA用量參見附表）到250 ml DMEM溶液，用槍輕輕吹打混勻。
5. 取另一只潔凈無菌離心管，加入250 ml DMEM溶液，再加入10 ml （其他培養(yǎng)介質(zhì) 用量參見附表），用槍輕輕吹打混勻,室溫放置5分鐘。
6. 將步驟4與5中的DNA溶液與 溶液混合，用槍輕輕吹打混勻。注意：不可Vortex或離心。
7. 室溫孵育20分鐘。有可能出現(xiàn)絮狀沉淀物，屬正常現(xiàn)象，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
8. 轉(zhuǎn)染試劑無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，均把500 ml -DNA混合物全部加入六孔板的一個(gè)孔內(nèi)。加入時(shí)注意盡量均勻加入到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕“8”字搖擺混勻。
注：針對(duì)貼壁細(xì)胞，如上述所說，只需將 -DNA復(fù)合物加入細(xì)胞中孵育6小時(shí)再換液即可。若是轉(zhuǎn)染懸浮或半懸浮細(xì)胞，則推薦通過平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的 -DNA復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后（步驟8），封口膜封好，放入平角離心機(jī)，低速（200 g）離心1.5 小時(shí)，然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6小時(shí)再換液即可。
9. 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-12小時(shí)后，去除含有 -DNA的無血清培養(yǎng)液。每孔加入2 ml新鮮含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注：通常 -DNA混合物和細(xì)胞一起孵育6小時(shí)已經(jīng)足夠產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染試劑大多數(shù)細(xì)胞和 -DNA一起培養(yǎng)長達(dá)72小時(shí)未見明顯細(xì)胞毒性。但轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液對(duì)于一些生長非常快速的細(xì)胞有助于提高轉(zhuǎn)染效率。對(duì)一些比較易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如HEK-293T細(xì)胞，換液可視細(xì)胞生長狀況而定，無需為提高轉(zhuǎn)染效率而換液。
10. 轉(zhuǎn)染后續(xù)處理：
1) 對(duì)于基因表達(dá)，再培養(yǎng)24-40小時(shí)后即可檢測轉(zhuǎn)染效果，如轉(zhuǎn)染帶GFP或者其他熒光基因的表達(dá)載體，可用熒光顯微鏡觀測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
2) 轉(zhuǎn)染試劑用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，則在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即可加入適當(dāng)?shù)暮Y選藥物，例如G418或Puromycin（嘌呤霉素）等，進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。
會(huì)員_a.png)